中华人民共和国国家标准
GB/T 5009.93-2003
果品制品－硒的测定－荧光法
1 范围
本方法适用于各类果品制品中硒含量的测定。
本方法的检出限为0.5ng/mL；线性范围为0ng/mL～400ng/mL。
2 原理
试样用混合酸消化，使硒化合物被氧化为无机硒Se4+，在酸性条件下Se4+与2，3-二氨基萘（2，3-diaminonaphthalene,缩写为DAN）反应生成4，5-苯丙苤硒脑（4，5-benzo piaselennol）,用环己烷萃取，在激发光波长376nm，发射光波长520nm处测定荧光强度，从而计算出试样中硒的含量。
3 试剂
3.1 混合酸液：将硝酸及高氯酸（70%～72%）按2+1体积混合；
3.2 去硒硫酸：取浓硫酸200mL，加于200mL水中，再加48%氢溴酸30mL，混匀，置沙浴上加热至出现浓白烟，此时体积应为200mL；
3.3 浓盐酸（相对密度为1.18）；
3.4 盐酸溶液（10%）：取10mL浓盐酸加90mL水；
3.5 氨水（氨水+水=1+1）；
3.6 环己烷：市售品需先测试有无荧光杂质，必要时重蒸后使用，用过的环已烷可再使用；
3.7 EDTA混合液
a）0.2 mol/L EDTA：称取EDTA二钠37g，加水并加热溶解，冷却后稀释至500mL；
b）100g/L盐酸羟胺溶液：称取10g盐酸羟胺溶于水中，稀释至100mL；
c）0. 2g甲酚红指示剂：称取甲酚红50mg溶于少量水中，加氨水（1＋1）1滴，待完全溶解后加水稀释至250mL；
将上述a）及b）液各取50mL ，加c）液5mL，加水稀释至1L。
3.8 硒标准溶液
准确称取元素硒（光谱纯）100.0mg，溶于少量浓硝酸中，加2mL高氯酸（70%～72%），至沸水浴中加热3h～4h，冷却后加入8.4mL盐酸（盐酸浓度为0.1mol/L），再置沸水浴中煮2min。准确稀释至1000mL。此为储备液（硒含量为100μg/mL）。应用时用0.1mol/L盐酸将储备液稀释至每毫升含0.5μg硒。于冰箱内保存；
3.9 DAN（1g/L）试剂
此试剂在暗室内配制。称取DAN（纯度为95%～98%）200mg于一带盖锥形瓶中，加入0.1mol/L盐酸200mL，振摇约15min，使其全部溶解，加入约40mL环己烷，继续振摇5 min ,将此液体倒入塞有玻璃棉（或脱脂棉）的分液漏斗中，待分层后，滤去环己烷层，收集DAN溶液层。反复用环己烷纯化直至环己烷中的荧光数值降至最低时为止（约纯化5次～6次）。将纯化后的DAN溶液储于棕色瓶中，加入约1cm厚的环己烷覆盖表层。置冰箱内保存。必要时再纯化一次。
警告：此试剂有一定毒性，使用本试剂的人员应有正规实验室工作经验。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关条例的规定。
4 仪器
荧光分光光度计。
5 操作步骤
5.1 试样处理
取可食部，用水冲洗三次后，用纱布吸去水滴，用不锈钢刀切碎，取一定量试样在鼓风烤箱中于60℃烘干，称量，计算水分，磨成粉保存，备用。计算时应折合成鲜样质量。
5.2 试样消化
称含硒量0.5g～2.0g试样于磨口锥形瓶内，加10mL5%去硒硫酸，试样润湿后，再加20mL混合酸液放置过夜。次日置沙浴上逐渐加热，当激烈反应后，溶液呈无色，继续加热至白烟产生，溶液逐渐变成淡黄色即达到终点。某些蔬菜试样消化后常出现浑浊，以至难以确定终点，这时可注意甁内出现白烟，此刻立即取下，溶液冷却后又变为无色。有些含硒较高的果品含有较多的Se6+，需要在消化完成后再加10mL10%盐酸，继续加热，使再回终点，以完全还原Se6+为Se4+，否则结果将偏低。
5.3 测定
上述消化后的试样溶液加入20mLEDTA混合液，用氨水（1＋1）或盐酸调至淡红橙色（pH 1.5～2.0）。以下步骤在暗室进行：加DAN试剂3mL，混匀后，置沸水浴中煮5min，取出立即冷却，加环己烷3mL，振摇4min，将全部溶液移入分液漏斗，待分层后弃去水层，小心将环己烷层由分液漏斗上口倾入试管中，勿使环己烷中混入水滴，于荧光分光光度计激发光波长376，发射光波长520nm测定苤硒脑的荧光强度。
5.4 硒标准曲线绘制
准确量取硒标准使用液（0.05μg/mL）0，0.2，1.0，2.0及4.0mL（相当于0.00，0.01，0.05，0.10，0.20μg硒），加水至5mL后，按试样测定步骤同时进行测定。
硒含量在0.5μg以下时荧光强度与硒含量呈线性关系，在常规测定试样时，每次只需做试剂空白与试样硒含量相近的标准管（双份）即可。
（下略）
