中华人民共和国国家标准
GB T 5009.35 2003
果品制品－合成着色剂的测定－高效液相色谱法
1 范围
本标准规定了食品中合成着色剂的测定方法。
本标准适用于食品中合成着色剂的测定。
本方法的最小检出量，新红5ng、柠檬黄4ng、苋菜红6ng、胭脂红8ng、日落黄7ng、赤藓红18ng、亮蓝26ng、当进样量相当0.025g时最低检出浓度分别为0.2mg/kg；0.16mg/kg；0.24mg/kg；0.32 mg/kg；0.28mg/kg；0.72mg/kg；1.04mg/kg。
2 原理
食品中人工合成着色剂用聚酰胺吸附法或液-液分配法提取，制成水溶液，注入高效液相色谱仪，经反相色谱分离，根据保留时间定性和与峰面积比较进行定量。
3 试剂
3.1 盐酸；
3.2 乙酸；
3.3 柠檬酸溶液：称取20g柠檬酸（C6H8O7•H2O），加水至100mL，溶解混匀；
3.4 氨水：量取氨水2mL，加水至100mL，混匀；
3.5 氨水-乙酸铵溶液（0.02mol/L）：量取氨水0.5mL，加乙酸铵溶液（0.02mol/L）至1000mL，混匀；
3.6 乙酸铵溶液（0.02mol/L）：称取1.54g乙酸铵，加水至1000mL，溶解，经滤膜（0.45μm）过滤；
3.7 饱和硫酸钠溶液；
3.8 硫酸钠溶液（2g/L）；
3.9 正己烷；
3.10 甲醇：经滤膜（0.5μm）过滤；
3.11 聚酰胺粉（尼龙6）：过200目筛；
3.12 甲醇-甲酸（6+4）溶液：量取甲醇60mL，甲酸40mL，混匀；
3.13 无水乙醇-氨水-水（7+2+1）溶液：量取无水乙醇70mL、氨水20mL、水10mL，混匀；
3.14 三正辛胺正丁醇溶液（5%）：量取三正辛胺5mL，加正丁醇至100mL，混匀；
3.15 pH6的水：水加柠檬酸溶液调pH值到6；
3.16 合成着色剂标准溶液：准确称取按其纯度折算为100%质量的柠檬黄、日落黄、苋菜红、胭脂红、新红、赤藓红、亮蓝、靛蓝各0.100g，置100mL容量瓶中，加pH6水到刻度。配成水溶液（1.00mg/mL）；
3.17 合成着色剂标准使用液：临用时上述溶液（3.16）加水稀释20倍，经滤膜（0.45μm）过滤。配成每毫升相当50.0μg的合成着色剂。
4 仪器
高效液相色谱仪，带紫外检测器，254nm波长。
5 分析步骤
5.1 试样处理
5.1.1 桔子汁、果味水、果子露汽水等：称取样品20.0～40.0g，放入100mL烧杯中。含二氧化碳的样品应加热驱除二氧化碳。
5.1.2 蜜饯类：称取5.00g～10.00g粉碎试样，放入100mL小烧杯中，加水30mL，温热溶解，若样品溶液pH值较高，用柠檬酸溶液调pH值到6左右。
5.2 色素提取
5.2.1 聚酰胺吸附法：样品溶液加柠檬溶液调pH值到6，加热至60℃，将1g聚酰胺粉加少许水调成粥状，倒入样品溶液中，搅拌片刻，以G3垂融漏斗抽滤，用60℃pH=4的水洗涤3次～5次，然后用甲醇-甲酸混合溶液洗涤3次～5次（含赤藓红的样品用5.2.2法处理），再用水洗至中性，用乙醇-氨水-水混合溶液解吸3次～5次，每次5mL，收集解吸液，加乙酸中和，蒸发至近干，加水溶解，定容至5mL。经0.45μm滤膜过滤，取10μL进高效液相色谱仪。
5.2.2 液-液分配法（适用于含赤藓红的试样）：将制备好的试样溶液放入分液漏斗中，加2mL盐酸、三正辛胺正丁醇溶液（5%）10mL～20mL，振摇提取，分取有机相，重复提取至有机相无色，合并有机相，用饱和硫酸钠溶液洗2次，每次10mL，分取有机相，放蒸发皿中，水浴加热浓缩至10mL，转移至分液漏斗中，加60mL正己烷，混匀，加氨水提取2次～3次，每次5mL，合并氨水溶液层（含水溶性酸性色素），用正己烷洗2次，氨水层加乙酸调成中性，水浴加热蒸发至近干，加水定容至5mL。经0.45μm滤膜过滤，取10μL进高效液相色谱仪。
5.3 高效液相色谱参考条件
5.3.1 柱：YWG-C18 10μm不锈钢柱4.6 mm（i.d）×250mm。
5.3.2 流动相：甲醇：乙酸铵溶液（pH=4，0.02mol/L）。
5.3.3 梯度洗脱：甲醇在流动相的含量：20%～35%（每min增加3%）；35%～98%，（每min增加9%）；98%继续洗脱6min。
5.3.4 流速：1mL/min。
5.3.5 紫外检测器，254nm波长。
5.4 测定
取相同体积样液和合成着色剂标准使用液分别注入高效液相色谱仪，根据保留时间定性，外标峰面积法定量。
(下略)
