中华人民共和国国家标准
GB4789.5-94
果品制品－志贺氏菌的测定－计数法
1 范围
本标准规定了果品制品中志贺菌的检验方法。
本标准适用于果品制品中毒样品中志贺氏菌的检验。
2 培养基和试剂
2.1 GN增菌液：将胰蛋白胨（20g）、葡萄糖（1g）、甘露醇（2g）、柠檬酸钠（5g）、去氧胆酸钠（0.5g）、磷酸氢二钾（4g）、磷酸二氢钾（1.5g）、氯化钠（5g）和蒸馏水1000mL分配好后，加热使其溶解，校正pH为7.0，分装每瓶225mL，115℃高压灭菌15min；
2.2 HE琼脂注：将月示胨（12g）、牛肉膏（3g）、乳糖（12g）、蔗糖（12g）、水杨素（2g）、胆盐（20g）、氯化钠（5g）溶解于400mL蒸馏水中作为基础液；将琼脂加入于600mL水中，加热溶解。加入甲液和乙液于基础液内，校正pH到7.5。再加入Andrade指示剂，并与琼脂液合并，待冷至50～55℃倾注平板，其中，甲液是用硫代硫酸钠34g、柠檬酸铁胺4g和蒸馏水100mL配制而成；乙液是用去氧胆酸钠10g和蒸馏水100mL配制而成；Andrade指示剂是用酸性复红0.5g、1mol/L氢氧化钠溶液16mL和蒸馏水100mL配制而成；
注：此培养基不可高压灭菌。
2.3 SS琼脂：SS琼脂的基础培养基是将牛肉膏（5g）、月示胨（5g）、三号胆盐（3.5g）溶解于400mL蒸馏水中；将琼脂（17g）加入600mL蒸馏水中，煮沸使其溶解，再将两液混合，121℃高压灭菌15min，保存备用；SS琼脂完全培养基的成分是：基础培养基（1000mL）、乳糖（10g）、柠檬酸钠（8.5g）、硫代硫酸钠（8.5g）、10%柠檬酸铁溶液（10mL）、0.1%煌绿溶液（0.33mL），将基础培养基加热溶化，按比例加入上述染料经外的其它成分，充分混合均匀，校正至pH7.0，加入中性红和煌绿溶液，倾注平板；
2.4 麦康凯琼脂：将蛋白胨（17g）、月示胨（3g）、猪胆盐（或牛、羊胆盐）（5g）和氯化钠（5g）溶解于400mL蒸馏水中，校正pH7.2；将琼脂（17g）加入600mL蒸馏水中，加热溶解。将两液合并，分装于烧瓶内，121℃高压灭菌15min备用；临用时加热溶化琼脂，趁热加入乳糖，冷至50～55℃时，加入结晶紫和中性红水溶液，摇匀后倾注平板；
注：结晶紫及中性红水溶液配好后须经高压灭菌。
2.5 伊红美蓝琼脂(EMB)：将蛋白胨（10 g）、磷酸氢二钾（2g）和琼脂（17g）溶解于蒸馏水（1000mL）中，校正pH 7.1分装于烧瓶中，121℃高压灭菌15min备用；临用时加入乳糖（10g）并加热溶化琼脂，冷至50～55℃时，加入2%伊红Y溶液（20mL）和0.65%美蓝溶液（10mL），摇匀，倾注平板；
2.6 三糖铁琼脂(TSI)：将蛋白胨（20g）、牛肉膏（5g）、乳糖（10g）、蔗糖（10g）、葡萄糖（1g）、氯化钠（5g）、硫酸亚铁铵（0.2g）、硫代硫酸钠（0.2g）溶解于1000mL蒸馏水中，校正pH7.4，加入琼脂（12g）加热至沸以溶化琼脂，再加入0.2%酚红水溶液12.5mL，摇匀。分装试管，装量宜多，以得到较高的底层。121℃高压灭菌15min；放置高层斜面备用；
2.7 葡萄糖半固体管：将蛋白胨（1g）、牛肉膏（0.3g）和氯化钠（0.5g）溶于100mL水中，校正pH7.4后加入琼脂（0.3g）加热溶解，再加入1.6%溴甲酚紫酒精溶液（0.1mL）和葡萄糖（1g），分装小试管，121℃高压灭菌15min；
2.8 半固体管：将蛋白胨（1g）、牛肉膏（0.3g）、氯化钠（0.5g）、琼脂（0.35～0.4g）及100mL水煮沸，使琼脂溶解，校正pH7.4，分装小试管，121℃高压灭菌15min，直立凝固备用；
2.9 葡萄糖铵琼脂：将氯化钠（5g）、硫酸镁（0.2g）、磷酸二氢铵（1g）、磷酸氢二钾（1g）、葡萄糖（2g）溶解于1000mL水中，校正pH6.8，再加琼脂（20g），加热溶化，加入指示剂0.2%溴麝香草酚蓝溶液40mL，混合均匀后分装试管，121℃高压灭菌15min，放成斜面；
2.10 尿素琼脂(pH7.2)：将蛋白胨（1g）、氯化钠（5g）、葡萄糖（1g）、磷酸二氢钾（2g）、0.4%酚红溶液（3mL）、蒸馏水（1000mL）配好后，校正pH，加入琼脂（20g），加热溶化后装瓶，121℃高压灭菌15min。冷至50～55℃，加入经除菌过滤的20%尿素溶液（100mL）。尿素的最终浓度为2%，最终pH应为7.2±0.1；
2.11 西蒙氏柠檬酸盐琼脂：将氯化钠（5g）、硫酸镁（0.2g）、磷酸二氢铵（1g）、磷酸氢二钾（1g）、柠檬酸钠（5g）溶解于1000mL蒸馏水中，校正pH6.8，再加入琼脂（1g）加热溶化，加入指示剂0.2%溴麝香草酚蓝溶液40mL，混合均匀后分装试管，121℃高压灭菌15min，放成斜面；
2.12 氰化钾(KCN)培养基：将蛋白胨（10g）、氯化钠（5g）、磷酸二氢钾（0.225g）、磷酸氢二钠（5.64g）、蒸馏水1000mL配好后分装烧瓶，121℃高压灭菌15min，放在冰箱内使其充分冷却。每100mL培养基加入0.5%氰化钾溶液2.0mL（最后浓度为1：10000），分装于12mm×100mm灭菌试管，每管约4mL，立刻用灭菌橡皮塞塞紧，放要4℃冰箱内，至少可保存两个月。同时，将不加氰化钾的培养基作为培养基，分装试管备用；
2.13 氨基酸脱羧酶试验培养基：将蛋白胨（5g）、酵母浸膏（3g）、葡萄糖（1g）、蒸馏水（1000mL）、1.6%溴甲酚紫-乙醇溶液（1mL）加热溶解后，每瓶分装100mL，分别加入赖氨酸、鸟氨酸等。L-氨基酸按0.5%加入，DL-氨基酸按1%加入；再校正pH至6.8；对照培养基中不加氨基酸，分装于灭菌的小试管内，每管0.5mL，上面滴加一层液体石蜡，115℃高压灭菌10min；
2.14 糖发酵管：将蛋白胨（10g）、牛肉膏（5g）、氯化钠（3g）、磷酸氢二钠（2g）、0.2%溴麝香草酚蓝溶液12mL、蒸馏水1000mL配好后，分装每瓶100mL，121℃高压灭菌15min；另将棉子糖、甘露醇、甘油、七叶苷及水杨苷分别配成10%溶液，同时高压灭菌。将5mL糖溶液加入100mL培养基中，以无菌操作分装小试管；
2.15 5%乳糖发酵管：将蛋白胨（0.2g）、氯化钠（0.5g）、 2%溴麝香草酚蓝溶液1.2mL溶解于50mL蒸馏水中，另外将也乳糖（5g）溶解于50mL蒸馏水中，分别灭菌121℃ 15min，将两液混合，以无菌操作分装于灭菌小试管中；
2.16 蛋白胨水、靛基质试剂：将蛋白胨（20g）、氯化钠（5g）和蒸馏水1000mL混合，调pH7.4,分装小试管，121℃灭菌15min；靛基质试剂包括柯凡克试剂和欧-波试剂：柯凡克试剂是将5g对二甲基苯甲醛溶解于75mL戊醇中，然后缓缓加入浓盐酸25mL；欧-波试剂是将1g对二甲基苯甲醛溶解于95mL95%乙醇中内，然后缓缓加入浓盐酸20mL；
2.17 志贺氏菌属诊断血清。
3 设备和材料
3.1 天平：称取检样用；
3.2 均质器或乳钵；
3.3 温箱；
3.4 显微镜；
3.5 灭菌广口瓶：500mL；
3.6 灭菌三角烧瓶：500mL，250mL；
3.7 灭菌平皿：90mm×15mm；
3.8 载玻片；
3.9 酒精灯；
3.10 灭菌金属匙或玻璃棒；
3.11 接种棒，镍铬丝；
3.12 试管架，试管篓；
3.13 硝酸纤维素滤膜：150mm×50mm，φ0.45μm。临用时切成两张，每张70mm×50mm，用铅笔划格，每格6mm×6mm。每行10格，分6行。灭菌备用。
(下略)
