中华人民共和国国家标准
GB T16771-1997
橙、柑、桔汁及其饮料－L-脯氨酸的测定－紫外分光光度法
1 范围
本方法规定了橙、柑、桔汁及其饮料中L-脯氨酸的测定方法。
本方法适用于判定橙、柑、桔浓缩汁和果汁，以及果汁含量不低于2.5%的橙、柑、桔汁饮料中L-脯氨酸的测定。
2 原理
L-脯氨酸与水合茚三酮作用，生成黄红色络合物。用乙酸丁酯萃取后的络合物，在波长509 nm 处测定吸光度，与标准系列溶液比较，确定样品中L-脯氨酸的含量。
3 试剂
本试验方法中，所用试剂均为分析纯；实验用水应符合GB 6682 中三级水规格。
3.1 甲酸；
3.2 乙酸丁酯；
3.3 无过氧化物乙二醇独甲醚的制备：将数粒锌粒放入乙二醇独甲醚中，在避光暗处放置2d；
3.4 3.0%茚三酮与二醇独甲醚溶液：称取3.0g水合茚三酮，溶解在100mL无过氧化物的乙二醇独甲醚溶液中，贮存在棕色瓶内，置避光处。此溶液易被氧化，应每周制备一次；
3.5 L-脯氨酸标准贮备溶液：称取0.0500gL-脯氨酸，精确至0.0001g，置于50mL烧杯中，加水溶解，转移到100mL棕色容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，贮存在4℃冰箱内。此溶液含L-脯氨酸为500 mg/L。
4 仪器
实验室常规仪器、设备及下列各项：
4.1 分光光度计；
4.2 具塞试管：25mL；
4.3 离心机：转速不低于4000 r/min，带10mL具塞离心管；
4.4 分析天平：感量0.1mg；
4.5 天平：感量10mg。
5 试液的制备
称取一定量混合均匀的样品（浓缩汁1.00g；果汁5.00g；果汁饮料和果汁型碳酸饮料10.00～200.0 g）于200mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，备用。
6 分析步骤
6.1 工作曲线的绘制
6.1.1 显色
吸取0.00，0.50，1.00，2.50，4.00，5.00mLL-脯氨酸贮备溶液于50mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，配制成0.0，5.0，10.0，25.0，40.0，50.0mg/L的L-脯氨酸标准系列溶液。
吸取上述标准系列溶液各1.0mL，分别置于6支25mL具塞试管中，各加1mL甲酸，充分摇匀，加2mL茚三酮乙二醇独甲醚溶液，摇匀。将6支试管同时置于1000mL烧杯的沸水浴中（电炉与烧杯间须垫石棉网，水浴液面须高于试管液面）。待烧杯中的水沸腾后，精确计时15min，同时取出6支试管，置于20～22℃水浴中冷却10min。
6.1.2 萃取、测定吸光度
在上述6支试管中各加10.0mL乙酸丁酯，盖塞，充分摇匀，使红色络合物萃取到乙酸丁酯液层中。静置数分钟，将试管中的乙酸丁酯溶液分别倒入10mL具塞离心管中，盖塞。以2500 r/min转速，离心5min。将上层清液小心倒入1cm比色皿中，以试剂空白溶液调整零点，在波长509nm处测定各上层清液的吸光度。以吸光度为纵坐标，L-脯氨酸的浓度为横坐标，绘制工作曲线或计算回归方程。
6.2 试液的测定
吸取1.0mL试液于25mL具塞试管中，以下步骤按6.1操作。从工作曲线上查出（或用回归方程计算出）试液中L-脯氨酸的含量。
(下略)
