中华人民共和国国家标准
GB T 5009.5-2003
果品制品－蛋白质的测定－分光光度法
1 范围
本方法适用于各类果品制品中蛋白质含量的测定。
本方法的检出限为0.070μg/mL；线性范围为0μg/mL～10.0μg/mL。
2 原理
蛋白质是含氮的有机化合物。样品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后在pH4.8的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中，铵与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的3，5-二乙酰-2，6-二甲基-1，4-二氢化吡啶化合物。在波长400nm处测定吸光度，与标准系列比较定量，结果乘以换算系数，即为蛋白质含量。
3 试剂
3.1 硫酸；
3.2 氢氧化钠溶液（300g/L）：称取30g氢氧化钠加水溶解后，放冷，并稀释至100mL；
3.3 硫酸铜；
3.4 硫酸钾；
3.5 对硝基苯酚指示剂溶液（1g/L）：称取0.1g对硝基苯酚指示剂溶于20mL95%乙醇中，加水稀释至100mL；
3.6 乙酸溶液（1mol/L）：量取5.8mL冰乙酸，加水稀释至100mL；
3.7 乙酸钠溶液（1mol/L）：称取41g无水乙酸钠或68g乙酸钠（CH3COONa•3H2O），加水溶解后并稀释至500mL；
3.8 乙酸钠-乙酸缓冲溶液：量取60mL乙酸钠溶液（1mol/L）和40mL乙酸溶液（1mol/L），该溶液为pH4.8；
3.9 显示剂：15mL37%甲醛和7.8mL乙酰丙酮混合，加水稀释至100mL，剧烈振摇，混匀（室温下稳定放置三日）；
3.10 氨氮标准溶液（1.0g/L）：精密称取105℃干燥2h的硫酸铵0.4720g，加水溶解后移入100mL容量瓶中，并稀释至刻度，混匀，此溶液每毫升相当于1.0mgNH3-N（10℃下冰箱内储存稳定1年以上）；
3.11 氨氮标准使用溶液（0.1g/L）：用移液管精密吸取10mL氨氮标准储备液（1.0mg/mL）于100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀，此溶液每毫升相当于100μg NH3-N（10℃下冰箱内储存稳定1个月）。
4 仪器
4.1 分光光度计；
4.2 电热恒温水浴锅（100℃±0.5℃）；
4.3 10mL具塞玻璃比色皿。
5 分析步骤
5.1 试样消解
精密称取经粉碎混匀过40目筛的固体试样0.1g～1.0g或半固体试样0.2g～1.0g或吸取液体试样1mL～5mL，移入干燥的100mL或250mL定氮瓶中，加0.1g硫酸铜、0.1g硫酸钾及5mL硫酸，摇匀后于瓶口放一漏斗，将瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上。小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5h。取下放冷，小心加20mL水，放冷后移入50mL或100mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。取与处理试样相同量的硫酸铜、硫酸钾、硫酸按同一方法做试剂空白试验。
5.2 试样溶液的制备
精密吸取2mL～5mL试样或试剂空白消化液于50mL～100mL容量瓶内，加1滴～2滴对硝基酚指示剂溶液（1g/L），摇匀后滴加氢氧化钠溶液（300g/L）中和至黄色，再滴加乙酸（1mol/L）至溶液无色，用水稀释至刻度，混匀。
5.3 标准曲线的绘制
精密吸取0，0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL氨氮标准使用溶液（相当于NH3-N 0，5.0，10.0，20.0，40.0，60.0，80.0，100.0μg），分别置于10mL比色管中。加4mL乙酸钠-乙酸缓冲溶液（pH4.8）及4mL显色剂，加水稀释至刻度，混匀。置于100℃水浴中加热15min。取出用水冷却至室温后，移入1cm比色皿内，以零管为参比，于波长400nm处测量吸光度，根据标准各点吸光度绘制标准曲线或计算直线回归方程。
5.4 试样测定
精密吸取0.5mL～2.0mL（约相当于氮小于100μg）试样溶液和同量的试剂空白溶液，分别于10mL比色管中。加4mL乙酸钠-乙酸缓冲溶液（pH4.8）及4mL显色剂，加水稀释至刻度，混匀。置于100℃水浴中加热15min。取出用水冷却至室温后，移入1cm比色皿内，以零管为参比，于波长400nm处测量吸光度。试样吸光度与标准曲线比较定量或代入标准回归方程求出含量。
(下略)
