中华人民共和国国家标准
GB/T 5009.27-2003
果品制品－苯并(a)芘的测定－荧光分光光度法
1 范围
本方法规定了食品中苯并(a)芘的测定方法。
本方法适用于果品制品中苯并(a)芘的测定。
2 原理
样品先用有机溶剂提取，或经皂化后提取，再将提取液经液－液分配或色谱柱净化，然后在乙酰化滤纸上分离苯并(a)芘，因苯并(a)芘在紫外光照射下呈蓝紫色荧光斑点，将分离后有苯并(a)芘的滤纸部分剪下，用溶剂浸出后，用荧光分光光度计测荧光强度与标准比较定量。
3 试剂
3.1 无水硫酸钠：120℃烤2h以上；
3.2 氢氧化钾；
3.3 无水乙醇：重蒸馏；
3.4 乙醇(95%)；
3.5 苯：重蒸馏；
3.6 环己烷(或石油醚，沸程30～60℃)：重蒸馏或经氧化铝柱处理无荧光；
3.7 二甲基甲酰胺或二甲基亚砜；
3.8 丙酮：重蒸馏；
3.9 展开剂：乙醇(95%)－二氯甲烷(2∶1)；
3.10 硅镁型吸附剂：将60～100目筛孔的硅镁吸附剂经水洗四次(每次用水量为吸附剂质量的4倍)于垂融漏斗上抽滤干后，再以等量的甲醇洗(甲醇与吸附剂量克数相等)，抽滤干后，吸附剂铺于干净瓷盘上，在130℃干燥5h后，装瓶贮存于干燥器内，临用前每100g加5g水减活，混匀并平衡4h以上，最好放置过夜；
3.11 层析用氧化铝(中性)：120℃活化4h；
3.12 乙酰化滤纸：将中速层析用滤纸裁成30cm×4cm的条状，逐条放入盛有乙酰化混合液(180mL苯、130mL乙酸酐、0.1mL硫酸)的500mL烧杯中，使滤纸充分地接触溶液，保持溶液温度在21℃以上，时时搅拌，反应6h，再放置过夜。取出滤纸条，在通风橱内吹干，再放入无水乙醇中浸泡4h，取出后放在垫有滤纸的干净白瓷盘上，在室温内风干压平备用，一次可处理滤纸15～18条；
3.13 苯并(a)芘标准溶液：精密称取10.0mg苯并(a)芘，用苯溶解后移入100mL棕色容量瓶中，并稀释至刻度，此溶液每毫升相当于苯并(a)芘100μg。放置冰箱中保存；
3.14 苯并(a)芘标准使用液：吸取1.00mL苯并(a)芘标准溶液置于10mL容量瓶中，用苯稀释至刻度，同法依次用苯稀释，最后配成每毫升相当于1.0及0.1μg苯并(a)芘两种标准使用液，放置冰箱中保存。
4 仪器设备
4.1 层析柱：内径10mm，长350mm，上端有内径25mm，长80～100mm内径漏斗，下端具有活塞；
4.2 层析缸(筒)；
4.3 K－D全玻璃浓缩器；
4.4 紫外光灯：带有波长为365nm或254nm的滤光片；
4.5 回流皂化装置：锥形瓶磨口处连接冷凝管；
4.6 组织捣碎机；
4.7 荧光分光光度计。
5 试样制备
5.1 样品提取
饮料(如含二氧化碳先在温水浴上加温除去)：吸取50.0～100.0mL样品于500mL分液漏斗中，加2g氯化钠溶解，加50mL环己烷振摇1min，静置分层，水层分于第二个分液漏斗中，再用50mL环己烷提取一次，合并环己烷提取液，每次用100mL水振摇、洗涤二次，收集环己烷于50～60℃水浴上减压浓缩至25mL，加适量无水硫酸钠脱水。
可用石油醚代替环己烷，但需将石油醚提取液蒸发至近干，残渣用25mL环己烷溶解。
6 操作步骤
6.1 净化
于层析柱下端填入少许玻璃棉，先装入5～6cm的氧化铝，轻轻敲管壁使氧化铝层填实、无空隙，顶面平齐，再同样装入5～6cm的硅镁型吸附剂，上面再装入5～6cm无水硫酸钠，用30mL环己烷淋洗装好的层析柱，待环己烷液面流下至无水硫酸钠层时关闭活塞。
将样品环己烷提取液倒入层析柱中，打开活塞，调节流速为每分钟1mL，必要时可用适当方法加压，待环己烷液面下降至无水硫酸钠层时，用30mL苯洗脱，此时应在紫外光灯下观察，以蓝紫色荧光物质完全从氧化铝层洗下为止，如30mL苯不足时，可适当增加苯量。收集苯液于50～60℃水浴上减压浓缩至0.1～0.5mL〔可根据样品中苯并(a)芘含量而定，应注意不可蒸干〕。
6.2 分离
在乙酰化滤纸条上的一端5cm处，用铅笔划一横线为起始线，吸取一定量净化后的浓缩液，点于滤纸条上，用电吹风从纸条背面吹冷风，使溶剂挥散，同时点20μL苯并(a)芘的标准使用液(1μg/mL)，点样时斑点的直径不超过3mm，层析缸(筒)内盛有展开剂，滤纸条下端浸入展开剂约1cm，待溶剂前沿至约20cm时取出阴干。
在365或254nm紫外光灯下观察展开后的滤纸条，用铅笔划出标准苯并(a)芘及与其同一位置的样品的蓝紫色斑点，剪下此斑点分别放入小比色管中，各加4mL苯加盖，插入50～60℃水浴中不时振摇，浸泡15min。
6.3 试样（样品）的测定
将样品及标准斑点的苯浸出液移入荧光分光光度计的石英杯中，以365nm为激发光波长，以365～460nm波长进行荧光扫描，所得荧光光谱与标准苯并(a)芘的荧光光谱比较定性。
(下略)
