中华人民共和国国家标准
GB T 5009.35 2003
果品制品－合成着色剂的测定－薄层色谱法
1范围
本方法规定了果品制品中合成着色剂的测定方法。
本方法适用于果品制品中合成着色剂的测定。
最低检出量为50μg，点样量为1μL时，检出浓度约为50mg/kg。
2 原理
水溶性酸性合成着色剂在酸性条件下被聚酰胺吸附，而在碱性条件下解吸附，再用纸色谱法或薄层色谱法进行分离后，与标准物质进行比较，定性、定量检测。
3 试剂
3.1 硫酸：（1+10）；
3.2 盐酸（1+10）；
3.3 柠檬酸溶液（200g/L）；
3.4 氢氧化钠溶液（50g/L）；
3.5 钨酸钠溶液（100g/L）；
3.6 石油醚：沸程60～90℃；
3.7 甲醇；
3.8 乙醇（50%）；
3.9 甲醇-甲酸溶液：（6+4）；
3.10 乙醇-氨溶液：取1mL氨水，加乙醇（70%）至100mL；
3.11 pH6的水：用柠檬酸溶液（20%）调节至pH6；
3.12 聚酰胺粉（尼龙6）：200目；
3.13 硅胶G；
3.14 海沙：先用盐酸（1+10）煮沸15min，用水洗至中性，再用氢氧化钠溶液（50g/L）煮沸15min，用水洗至中性，再于105℃干燥，贮于具玻璃塞的瓶中，备用；
3.15 碎瓷片：处理方法同3.14。
3.16 展开剂：
3.16.1 正丁醇-无水乙醇-氨水（1%）（6+2+3）：供纸色谱用；
3.16.2 正丁醇-吡啶-氨水（1%）（6+3+4）：供纸色谱用；
3.16.3 甲乙酮-丙酮-水（7+3+3）：供纸色谱用；
3.16.4 甲醇-乙二胺-氨水（10+3+2）：供薄层色谱用；
3.16.5 甲醇-氨水-乙醇（5+1+10）：供薄层色谱用；
3.16.6 柠檬酸钠溶液（25g/L）-氨水-乙醇（8+1+2）：供薄层色谱用；
3.17 合成着色剂标准溶液：准确称取按其纯度折算为100%质量的柠檬黄、日落黄、苋菜红、胭脂红、新红、赤藓红、亮蓝、靛蓝各0.100g，置100mL容量瓶中，加pH6到刻度。配成水溶液（1.00mg/mL）；
3.18 着色剂标准使用液：临用时吸取色素标准溶液各5.0mL，分别置于50mL容量瓶中，加pH6的水稀释至刻度。此溶液每毫升相当于0.10mg着色剂。
4 仪器
4.1 可见分光光度计；
4.2 微量注射器或血色素吸管；
4.3 展开槽，25cm×6cm×4cm；
4.4 层析缸；
4.5 滤纸：中速滤纸，纸色谱用；
4.6 薄层板：5cm×20cm；
4.7 电吹风机；
4.8 水泵。
5 分析步骤
5.1 试样处理
5.1.1 果味水、果子露、汽水：称取50.0g试样于100mL烧杯中。汽水需加热驱除二氧化碳。
5.1.2蜜饯类：称取5.00g或10.0g粉碎的试样，加30mL水，温热溶解，若样液pH值较高，用柠檬酸溶液（200g/L）调至pH4左右。
5.2 吸附分离
将处理后所得的溶液加热至70℃，加入0.5g～1.0g聚酰胺粉充分搅拌，用柠檬酸溶液（200 g/L）调pH至4，使着色剂完全被吸附，如溶液还有颜色，可以再加一些聚酰胺粉。将吸附着色剂的聚酰胺全部转入G3垂融漏斗中过滤（如用G3垂融漏斗过滤可以用水泵慢慢地抽滤）。用pH4的70℃水反复洗涤，每次20mL，边洗边搅拌。若含有天然着色剂，再用甲醇-甲酸溶液洗涤1次～3次，每次20mL，至洗液无色为止。再用70℃水多次洗涤至流出的溶液为中性。洗涤过程中必须充分搅拌。然后用乙醇-氨溶液分次解吸全部着色剂，收集全部解吸液，于水浴上驱氨。如果为单色，则用水准确稀释至50mL，用分光光度法进行测定。如果为多种着色剂混合液，则进行纸以谱或薄层色谱法分离后测定，即将上述溶液置水浴上浓缩至2mL后移入5mL容量瓶中，用乙醇（50%）洗涤容器，洗液并入容量瓶中并稀释至刻度。
5.3 定性
5.3.1 纸色谱
取色谱用纸，在距底边2cm的起始线上分别点3μL～10μL试样溶液、1μL～2μL着色剂标准溶液，挂于分别盛有3.16.1、3.16.2的展开剂的层析缸中，用上行法展开，待溶剂前沿展至15cm处，将滤纸取出于空气中晾干，与标准斑比较定性。
也可取0.5mL样液，在起始线上从左至右点成条状，纸的左边点着色剂标准溶液，依法展开，晾干后先定性后再供定量用。靛蓝在碱性条件下易褪色，可用3.16.3展开剂。
5.3.2 薄层色谱
5.3.2.1 薄层板的制备
称取1.6g聚酰胺粉、0.4g可溶性淀粉及2g硅胶G，置于合适的研钵中，加15mL水研匀后，立即置涂布器中铺成厚度为0.3mm的板。在室温晾干后，于80℃干燥1h，置干燥器中备用。
5.3.2.2 点样
离板底边2cm处将0.5mL样液从左到右点成与底边平行的条状，板的左边点2μL色素标准溶液。
5.2.2.3 展开
苋菜红与胭脂红用3.16.4展开剂，靛蓝与亮蓝用3.16.5展开剂，柠檬黄与其他着色剂用3.16.6展开剂。取适量展开剂倒入展开槽中，将薄层板放入展开，待着色剂明显分开后取出，晾干，与标准斑比较，如Rf值相同即为同一色素。
5.4 定量
5.4.1 试样测定
将纸色谱的条状色斑剪下，用少量热水洗涤数次，洗液移入10mL比色管中，并加水稀释至刻度，作比色测定用。
将薄层色谱的条状色斑包括有扩散的部分，分别用刮刀刮下，移入漏斗中，用乙醇-氨溶液解吸着色剂，少量反复多次至解吸液于蒸发皿中，于水浴上挥去氨，移入10mL比色管中，加水至刻度，作比色用。
5.4.2 标准曲线制备
分别吸取0、0.50、1.0、2.0、3.0、4.0mL胭脂红、苋菜红、柠檬黄、日落黄色素标准使用溶液，或0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL亮蓝、靛蓝色素标准使用溶液，分别置于10mL比色管中，各加水稀释至刻度。
上述试样与标准管分别用1cm比色杯，以零管调节零点，于一定波长下（胭脂红510nm，苋菜红520nm，柠檬黄430nm，日落黄482nm，亮蓝627nm，靛蓝620nm），测定吸光度，分别绘制标准曲线比较或与标准色列目测比较。
(下略)
